ATCC細胞復蘇和培養(yǎng)*手冊

　　ATCC細胞復蘇和培養(yǎng)*手冊
　　細胞是我們很多基礎研究的基礎，那么細胞能否被成功復蘇就尤為重要了。
　　美國菌種保藏中心， 又稱美國模式菌種收集中心(ATCC)，是位于馬里蘭洲洛克菲勒的一家私營的，非贏利性組織。目前它可以提供各種動植物細胞、標準品、菌株達兩萬多種。以下是來自ATCC的*說明，小凳子搬起來。
　　01　　收到細胞的注意事項
　　凍存的ATCC細胞株和雜交瘤細胞株在運送過程中使用干冰保持低溫。收到凍存細胞后，可以立即解凍復蘇，去除二甲基亞砜（DMSO）后進行細胞培養(yǎng)。如果不立即復蘇培養(yǎng)細胞，必須將細胞凍存管放置于液氮罐存儲。請不要將細胞存儲在-130℃以上的溫度。如果溫度不夠低，達不到-130℃，細胞活力會迅速下降。
　　對于浸沒在液氮中細胞，在復蘇時需要特別留意，如果在存儲過程中凍存管出現(xiàn)泄露，液氮會緩慢的進入其中；這樣在解凍的過程中，液氮的揮發(fā)可能會導致凍存管爆炸或將凍存管蓋掀起，引起碎片飛濺非常危險。
　　安全防護：在從液氮中取凍存管以及解凍的過程中，要始終穿戴防護服、手套以及面罩。
　　2　　產(chǎn)品說明書和質檢報告（COA）
　　ATCC每個細胞株都有一份產(chǎn)品說明書（product sheet），其中包含細胞株的信息和詳細的操作指南。細胞株的所有詳細介紹可以在 ATCC 網(wǎng)站找到，產(chǎn)品說明書和COA也可以從ATCC網(wǎng)站下載。
　　3　　凍存細胞的復蘇和培養(yǎng)
　　1. 準備工作
　　先準備好細胞培養(yǎng)皿或細胞培養(yǎng)瓶，及產(chǎn)品說明推薦的相應細胞培養(yǎng)基。并在37℃水浴中預先溫熱細胞培養(yǎng)基。
　　2. 37℃水浴
　　小心取出裝有細胞的凍存管，保持管蓋擰緊，將凍存管蓋以下的部分置于37℃水浴中并輕微的攪拌以幫助解凍。解凍過程應該盡快，大約短于2分鐘或待后一塊小冰晶體剛融化，就應將細胞凍存管取出水浴。
　?。ㄗ⒁猓阂欢ㄒ焖偃诨?，避免冰晶緩慢融化時進入細胞形成再結晶，對細胞造成損害。所以，要避免水浴鍋內(nèi)凍存管太多，導致溫度不夠）
　　3. 消毒和無菌
　　在從水浴中取出的細胞凍存管表面噴灑70%乙醇配制的消毒劑，用無菌紙巾或紗布試干。之后的操作步驟都應該遵循在無菌條件下生物安全柜中嚴格操作。
　　注意：隨時更換吸頭和吸管，避免交叉污染。
　　4. 離心
　　小心擰開凍存管的頂部，將管內(nèi)容物用1ml移液槍轉移到含9毫升培養(yǎng)基的無菌離心管中。離心5到7分鐘(125×g),小心吸去上清液以去除抗凍劑(二甲基亞砜)，避免丟失細胞沉淀。
　　注意：對于多數(shù)細胞系而言，不需要立即去除凍存液，通?？稍趶吞K后8-24小時換液進行去除（但對于一些對凍存液敏感的細胞，我們就需要先進行細胞離心以除去凍存液）。
　　5. 重懸
　　將細胞沉淀重懸于配好的*培養(yǎng)基中。將細胞懸液轉移到培養(yǎng)容器，輕輕搖晃使細胞均勻的分布。
　　生長較慢的細胞株可重懸于5-8ml培養(yǎng)基并轉移到T25培養(yǎng)瓶。生長較快的細胞株可重懸于12-20ml培養(yǎng)基并轉移到T75培養(yǎng)瓶。ATCC網(wǎng)站有各個細胞株的具體生長狀況及培養(yǎng)方法記載。
　　A. 復蘇過程中應避免使用過度堿性的培養(yǎng)液（通常我們的培養(yǎng)液中都含有酚紅作為pH指示劑，因此這里既盡量不要使用因偏堿而變紫的培養(yǎng)液）。建議事先將培養(yǎng)容器中加入培養(yǎng)液，置于培養(yǎng)箱中孵育不少于15min，以使培養(yǎng)液達到其正常的pH值，然后再加入凍存的細胞。
　　B.某些細胞系在解凍后，當過于快速的加入大量新鮮培養(yǎng)基時可能會出現(xiàn)滲透壓休克。此時應使用20°C-37°C下多次、少量、逐步增加（每次1-2ml）新鮮培養(yǎng)液的方法，每隔10-20min添加一次新鮮培養(yǎng)液。
　　6. 培養(yǎng)
　　將細胞培養(yǎng)容器置于細胞培養(yǎng)箱，在溫度37℃, 二氧化碳濃度5%的培養(yǎng)條件下進行孵育。細胞培養(yǎng)24小時后應在顯微鏡下觀察細胞形態(tài)和生長狀況。
　　為了確保細胞活力、遺傳基因型穩(wěn)定和表型的穩(wěn)定，細胞株的培養(yǎng)需要保持在對數(shù)期。這意味著需要定期對細胞進行傳代。并且注意在細胞進入生長平臺期之前，即單層細胞100%匯合長滿前或懸浮細胞達到其推薦的大細胞密度之前，要進行細胞傳代。監(jiān)測細胞生長和繪制每個細胞株的生長曲線都有助于確定細胞株的生長特性。